日本血吸虫（中国大陆株）特异性IgE抗体相关抗原和表位筛选与鉴定

当前，血吸虫病仍然是严重危害人类健康和生命的主要寄生虫病种。在防治策略上，以吡喹酮化疗为主，结合药物灭螺、有螺环境改造和健康教育的综合性防治措施取得明显效果。但在广大的江湖洲滩地区，因环境复杂，灭螺成本高，人畜活动频繁，控制血吸虫病的传播上缺乏十分有效的手段。加之流行区血吸虫再感染的反复发生，现行的控制措施明显不能满足防治形势的需要，迫切要求新的措施介入。因此，血吸虫病疫苗研究及可为疫苗研究提供有益线索的血吸虫感染免疫和免疫病理机制的研究，备受关注。在对血吸虫感染免疫和免疫病理机制获得不断深入熟悉的基础上，继续寻找新的具免疫保扩作用的疫苗候选分子，是血吸虫病疫苗研究工作的重要内容。大量的血清流行病学资料和实验室研究的证据表明，血吸虫特异性IgE抗体在抗血吸虫感染免疫中发挥重要作用。在此基础上提出的发展以诱导特异性IgE抗体应答的血吸虫病疫苗的研究策略，具有充分的现实可行性。为此，本研究首先从日本血吸虫成虫cDNA文库中筛选和克隆血吸虫特异性IgE抗体相关蛋白编码基因，再亚克隆入表达质粒载体并实现原核表达。接着通过生物信息学分析，获得核苷酸及其编码蛋白的组成、结构和同源性的相应资料。进一步对纯化的原核表达蛋南京医科大学博士学位论文蛋白的免疫原性、诱导机体免疫应答的特征及其在抗血吸虫攻击感染中的免疫保护作用和对肝虫卵肉芽肿形成和肝纤维化的影响，以及诱导产生的特异性抗体在体外通过AmC效应的杀血吸虫童虫机制等方面进行试验和观察，并结合该蛋白分子在血吸虫体内的分布特征，以综合评价其在抗血吸虫感染免疫中的作用和意义。本研究还对日本血吸虫特异性IgE抗体相关肽表位诱导免士疫应答的特征及在抗血吸虫感染保护性免疫中的作用，进行了初步的试验观察。研究内客包括以下方面：一．日本血吸虫特异性IgE抗体相关抗原编码基因的克隆ABC斗LSA法从日本血吸虫病流行区居民中筛选具高水平抗日本血吸虫成虫抗原IgE抗体的个体，采血并分离血清。将混合血清用Proteil。G柱吸。1丈以去除乃G型干扰抗体后，用于日本血吸虫成虫CDNA文库的免疫学筛选；用羊抗人IgE抗体二抗以保证筛选获得乃非抗体的特异性克隆。F巳性克隆插入片断经KR扩增，用于nA序歹。J测定。jNIJ序结果显示，该插入片断为1200hP，第一开读框长507hP，编码169个氨基酸残基，理论分子量为19．3kDI。该M八序列与已知血吸虫基固序列相寸性小于40％，初步提示为新的日本血吸虫蛋白编码序列，命名为Sj43B。于插入片断两侧重新设计引物并5］入ECOR和NOti位点，将其先克隆入PGME丁载体；重复测序结果与KR产物测序相同，再亚克隆入表达载体构建重组质粒Sj扔B冲GEX乃P十。nIPTG诱导表达，产物沉淀中于约45kDa处显见高合蛋白表达带，Westernblot分析表明，该蛋白带可被筛库血清中特异性lgE抗体识别；而载体本身表达的26GST蛋白带则否。表明通过免疫学筛选和基因重组表达，获得了血吸虫特异性IgE抗体相关蛋白。借助现行生物信息学分析手段，通过互联网进入GenBank数据库，对Sj43B与已知序列进行同源性比对，应用DNAtOOIS软件对其编码蛋白序列的氨基酸纽成、亲水性、抗原性和可及性进行分析，并在blastp程序下在GenBank蛋白数据库中对Sj43B编码－3－人卞医科大学博士学杠论文蛋白进行同源性检索。结果显示，Sj43B基因核菩酸序列与己知序歹J的Scores分值均。J、＋200，提示Sj43B为一新的蛋白编码序列。该基因编码蛋白的等电点是5．89，其亲水性、抗原性和可及性分布曲线基本一致，猜测抗原表位分另IJ在第25－35位、75－82位、1H－1们位、117－1n位和149－159位氨基酸残基。蛋白同源性分析显示，Sj43B编码蛋白与来自人和＊、鼠的含洲3结构‘域蛋白的同源性为3洲。这一结果对提示该蛋白可能的功能作用，具有重要的参考价值。H．Sj43B／PGEX－6P－1重组质粒的诱导表达、表达产物的乡寸和免疫学性质鉴定分析为获得可溶性的rsj43B月6GSTA虫合蛋白，对不同IPTG诱导剂浓度、诱导表达温度和诱导表达时间等因素对融合蛋白可溶性表达的影响进行了观察。结果显示，在k05flllllOUL一2．0mmoUL的IPTG浓度、15C－37C诱导表达温度和lh－411诱导表达时间范围内，改变相应条件对重组蛋白的可溶性表【关键词】：日本血吸虫基因克隆重组蛋白Sj43B基因包涵体蛋白纯化抗体同型免疫电镜虫卵肉芽肿胶原ADCC噬菌体表面显示肽库抗原表位
【论文提纲】：一．摘要3-181．中文摘要3-92．英文摘要9-18二．前言18-27三．研究内容27-133研究一．日本血吸虫特异性IgE抗体相关抗原编码基因的克隆27-42研究二．Sj43B基因的生物信息学分析42-51研究三．Sj43B基因编码蛋白诱导表达条件观察51-58研究四．rSj43B／26GST融合蛋白的纯化58-66研究五．rSj43B／26GST融合蛋白的免疫学鉴定分析66-75研究六．Sj43B基因编码蛋白的虫体组织定位75-84研究七．rSj43B／26GST融合蛋白的小鼠免疫／攻击感染试验84-92研究八．rSj43B／26GST融合蛋白免疫小鼠攻击感染后肝脏虫卵肉芽肿组织病理学分析92-106研究九．rSj43B／26GST融合蛋白免疫鼠血清体外ADCC杀血吸虫童虫效应106-115研究十．日本血吸虫特异性IgE抗体相关肽表位的筛选和初步鉴定115-126研究十一．日本血吸虫特异性ISE抗体相关肽表位免疫保护性的研究126-133四．结语133-137五．致谢137-139六．综述：血吸虫特异性IgE抗体相关抗原研究139-150七．附件150-1511．博士在读期间发表的论文150-1512．博士在读期间负责或介入完成的科研课题151